tr>

105 3-1-2-2-3 برش آنزیمی 105 4-1-2-2-3 تعیین توالی ژن­هایCstH::Cbm  وCstH::Cbβm  در کلون­های نوترکیب 106 3-2-3 کلونینگ ژن­هایcstH::cbm  و cstH::cbβm در اپرون cst 108 1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبرید cst::cbm و  cst::cbbm 109 1-1-3-2-3  تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی 110 2-1-3-2-3  تائید کلونیگ با PCR 112 4-2-3 بررسی بیان پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط روش­های دات­بلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین 113 1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری 114 2-4-2-3 وسترن بلاتینگ 115 5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلی­های هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm  توسط رنگ­آمیزی ایمونوفلورسانس 117 6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتری­های بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب 119 1-6-2-3 جذب کادمیم 120 2-6-2-3 اختصاصیت اتصال فصل چهارم: بحث و نتیجه­گیری 123 1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستم­های بیان پروتئین 124 2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن 129 3-4 مقایسه موتیف­های طراحی­شده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتری­های نوترکیب ساخته­شده در این پروژه با مطالعات پیشین 135 4-4 پیشنهادات 136 منابع 144 پیوست­ها

 

فهرست جدول­ها

عنوان صفحه
جدول 1-1. موتیف­های حفظ شده و اختصاصی متصل شونده به یونهای فلزی 8
جدول 1-2. مهمترين صنايع توليد كننده فاضلاب حاوي فلز سنگين 15
جدول 1-3. خانواده­های مهم پروتئین­های دخیل در نقل وانتقالات فلزات سنگین در باکتری­ها 22
جدول1 -4. ارگانل­های سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل می­شوند 35
جدول 1-5. خلاصه ای از اپی توپ­ها و موتیف­های ارائه شده توسط پیلی­ها 38
جدول 2-1. پایگاه­های­داده و برنامه­های بیوانفورماتیکی 42
جدول 2-2.ابزارهای مقایسه توالی 43
جدول 2-3. ابزارهای آنالیز توالی اول پروتئین 43
جدول 2-4. روش­های جستجوی پروفایل و پترن 44
جدول 2-5. ابزارهای پیش­گویی ساختار دوم 44
جدول 2-6. ابزارها و روش های پیش­گویی ساختار سوم 45
جدول 2-7. ابزارهای آنالیز و مشاهده ملکولی 46
جدول 2-8. مشخصات پلاسمیدهای استفاده شده و یا ساخته شده در این تحقیق 56
جدول 2-9. مشخصات اوليگونوکلئوتيد­های استفاده شده در اين تحقيق 57
جدول 2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR 65
جدول 2-11. واكنش برش آنزيمي پلاسمید pPR322 67
جدول 2-12. تركيبات مورد استفاده براي واكنش الحاق 68
جدول 3-1 توالی اسید آمینه ای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتی­ژنی F1 81
جدول 3-2. ویژگیهای ساختاری الگو-هدف که توسط روش­های محاسباتی به همراه امتیازات نمره­دهی بدست آمده­است 87
جدول 3-3. مناطق و اسیدهای­آمینه درگیر در ارتباطات ملکولی و غیرقابل دسترس ملکول CstH 94
جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+, Cu2+  و Cr3+ بر جذب Cd2+ در حضور کادمیوم 121
4 -1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستم­های نمایش­سطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق 133

 

فهرست شکل­ها

عنوان صفحه
شکل 1-1. بخشی از اطلاعاتی که از پایگاه داده Swiss-Prot برای زیر واحد اصلی پروتیئن  CS3 6
شکل 1-2. برخی از عناصر سنگین مهم در طبیعت 14
شکل 1-3. آرایش عناصر ساختار دوم دومین HMA در پروتئین CadA و  اندرکنش فلز سنگین با اسیدهای آمینه سیسئین موجود در پروتئین ناقل فلز سنگین 23
شکل 1-4. ساختار شیمیایی فیتوچلاتین طبیعی و فیتوچلاتین سنتزشده 26
شکل 1-5. ترکیبات سطحی باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت 27
شکل 1-6. عرضه سطحی در باکتریهای گرم منفی 29
شکل 1-7. دیاگرام شمایتک از سرهم بندی پیلی توسط مسیر چاپرون و آشر. 34
شکل 1-8. سازماندهی ژنتیکی لوکوس­های اپرون CS3 ، فلش­ها جهت پروموتر­ها را نشان می­دهد 39
شکل 2-2. خلاصه مراحل مدل­سازی پروتئین­ها 48
شکل 2-3. SOEing-PCR برای وارد کردن موتیف متصل شونده به فلز سنگین در جایگاه مجاز 38 و ساخت وکتور بیانی 66
شکل2-4 .نقشه ژنتیکی پلاسمیدهای دارنده ژن کامل اپرون  cst  ( pPM4567 )  و ژنcstH  (pPM4555) 74
شکل 3-1. پترن توافقی دومین  اتصال به فلزات سنگین (HMA_1) و  نمایش لوگوی توالی پترن 77
شکل3-2. توالی  و نمودار شماتیک مربوط به دومین HMA _1  در پروتئین CadA 78
شکل 3-3. تطابق توالی بر مبنای ساختار دوم در منطقه انتهای آمینی انواع پروتئین­های دسته P1-type ATPases 79
شکل 3-4. همردیفی توالی- ساختاری بین پروتئین های الگو-هدف 85
شکل 3-5. همردیفی توالی الگو و هدف زیرواحد اصلی و چاپرون دو پیلی CS3 و F1 antigen 86
شکل .3-6. مدل­های تولید شده برای دو پروتئین CstH (سمت چپ) و CS3-1 88
شکل 3-7. ارزیابی پایداری دو ملکول CstH  وCS3-1  در طی شبیه سازی دینامیک ملکولی 88
شکل 3-8. بررسی کیفیت مدل های CstH و  cs3-1توسط سرور تحت شبکه Prosa و نقشه راما چاندران با سرور Procheck 90
شکل 3-9. کاندیدهای جایگاه های مجاز 91
شکل 3-10. آنالیز در معرض قرارگیری مدل CstH با کمک نرم افزار Discovery Studio 2.5 92
شکل 3-11. آنالیز مدل CstH با سرور VADAR 92
شکل 3-12. پیش گویی  پیش­گویی ساختار دوم زیرواحد اصلی پیلی  CstHو موقعیت نسبی مناطق مجاز بر روی آن

 

95
شکل 3-13. مدل سه بعدی CstH و موقعیت جایگاه های مجاز در آن

شکل 3-14. مقایسه ساختاری الگوها با مدل هیبرید و آنالیز و بررسی در معرض قرارگیری موتیف متصل شونده به فلز سنگین

96

97

شکل 3- 15. ساخت کاست های ژنی از ترکیب ژن cstH و توالی متصل شونده به کادمیوم 99
شکل 3–16. الکتروفورز محصولات SOEing-PCR 100
شکل 3-17. نحوه کلونینگ محصولات SOEing PCR در ناقل pBR322 102
شکل 3-18. الکتروفورز DNA پلاسمید pBR322 و کلون­های نوترکیب بر روی ژل آگارز یک درصد 103
شکل 3- 19. الکتروفورز محصولاتPCR  کلون های نوترکيب

شکل 3-20. الکتروفورز محصول برش آنزیمی DNA نوترکیب با آنزیم­های  AocI و. BamH1

104

105

شکل3- 21. شکل شماتیک کلونینگ ژن هیبرید cstH::cbm و  cstH::cbβm در اپرون پیلی CS3 107
شکل3 -22. برش آنزیمی پلاسمید pPM4567 و پلاسمید­های نوترکیب 108
شکل 3-23. الکتروفورز DNA پلاسمید­های نوترکیب pEYSm2 و pEYSbm2 روی ژل آگارز یک درصد. 109
شکل3-24. الکتروفورز برش آنزیمی DNA پلاسمید­های حامل اپرون نوترکیب با آنزیم HindIII بر روی ژل آگارز یک درصد 110
شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلون­های نوترکیب حامل کل اپرون بر روی ژل آگارز یک درصد. 112
شکل 3-26. دات بلاتینگ باکتری E. coli بیان کننده پیلی هیبرید با استفاده از آنتی­بادی CS3 113
شکل 3-27. وسترن بلاتینگ باکتری E. coli بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتیCS3. 115
شکل 3-28. تصاویر میکروسکوپ فلوئورسانس باکتریE. coli  بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتی­بادی CS3 116
شکل 3- 29. منحنی ظرفیت جذب کادمیوم در باکتری بیان کننده موتیف اتصالی به کادمیوم و باکتری E. coli میزبان 117
شکل 3-30. بررسی اثر عامل زمان بر جذب کادمیوم در باکتری­های مهندسی شده 118
شکل 3-31. مقایسه جذب کادمیوم در سلولهای کنترل و سلولهای نوترکیب 120
شکل 4- 1.  ساختار دمین متصل شونده به فلز واقع در انتهای­آمینی پروتئین CadA باکتری لیستریا